流式細(xì)胞術(shù)作為一項(xiàng)生命科學(xué)領(lǐng)域的重要技術(shù),想要使用好自然是不容易。相信不少小伙伴在使用幾次之后,還是會(huì)有云里霧里的感覺。真正想掌握好一門技術(shù),還是得從基礎(chǔ)部分就做好。話不多說,直接上干貨!
1 如何搭配流式抗體熒光標(biāo)記?
流式抗體熒光標(biāo)記搭配主要由3個(gè)因素決定:流式細(xì)胞儀能檢測多少個(gè)通道、需要同時(shí)檢測多少個(gè)指標(biāo)、廠家的抗體有多少種熒光標(biāo)記。流式細(xì)胞儀的通道越多,那么同一份樣本能同時(shí)檢測的表面/胞內(nèi)/核內(nèi)蛋白就越多。
以Calibur為例說明:Calibur的FL1通道選擇了FITC就不能選擇AlexaFluro488,或者選擇了Alexa Fluro488就不能選FITC;Calibur的FL3通道盡管能檢測PE-Texas Red, PE-Cy5, PerCP, PerCP-Cy5.5, PE-Cy7五個(gè)熒光素,但是我們搭配的時(shí)候只能選擇其中1個(gè)。
如果流式細(xì)胞儀能做4個(gè)通道,在第1個(gè)原則之下,那么每個(gè)通道隨便選出1個(gè)熒光素就可以組合成4個(gè)顏色。以2根激光的Calibur為例,如常用的搭配是FITC(FL1)+PE(FL2)+PerCP(FL3)+APC(FL4), 這個(gè)搭配組合可以更改成Alex Fluro488(FL1)+PE(FL2)+PerCP(FL3)+APC(FL4), 或者FITC(FL1)+PE(FL2)+PerCP(FL3)+AlexFluro647(FL4),或者FITC(FL1)+PE(FL2)+PE- Cy5(FL3)+APC(FL4)等多種組合??傊诘谠瓌t之下,我們可以隨意搭配和組合各個(gè)熒光素。但是需要注意的是,APC和PE-Cy5一起使用的話,容易導(dǎo)致補(bǔ)償度,因此,通常我們不會(huì)將這兩種熒光素一起使用,即使他們不在同一通道檢測。
流式細(xì)胞儀有哪些激光
比如,標(biāo)配的FACSCalibur只有一根488nm的激光,能做FL1、FL2、FL3三個(gè)熒光通道/三個(gè)顏色,而選配的Calibur (FACSCalibur的簡稱)配有488nm和635nm兩根激光,可以檢測FL1-FL4四個(gè)通道/4個(gè)顏色。不同型號(hào)的流式細(xì)胞儀的同樣的一個(gè)通道檢測熒光素的能力不一樣比如Calibur的FL3(第3通道)能檢測PE-TexasRed, PE-Cy5, PerCP, PerCP-Cy5.5,PE-Cy7,而FACSAria的第3 通道只能檢測PE-Texas Red,PE-Cy5, PerCP。Calibur第3通道能檢測的PerCP-Cy5.5在FACSAria上是第4通道檢測。Calibur和LSR都能檢測4個(gè)顏色,但是第4個(gè)通道檢測的熒光素是不一樣的。
3 如果檢測的指標(biāo)數(shù)目超過了流式細(xì)胞儀的通道,怎么辦?
如果需要做5個(gè)指標(biāo),而流式細(xì)胞儀只能做4個(gè)通道,首先將指標(biāo)歸成2類,再將樣本分成2份,分別檢測。比如需要同時(shí)檢測CD3、CD4、CD8、IL-4和IFN-gamma,可以將樣本分成兩份,第1份加CD3、CD4、CD8 和IL-4,而第2份加CD3、CD4、CD8和IFN-gamma。具體的歸類方式可根據(jù)課題的設(shè)計(jì)來進(jìn)行。
4 流式檢測樣本如何保存?
全血樣本:一般來說,血液樣本必須在6個(gè)小時(shí)內(nèi)處理,晚不得超過12小時(shí);做完染色后,需要放在多聚甲醛中保存,一般可以存放3天左右。培養(yǎng)細(xì)胞樣本:培養(yǎng)的細(xì)胞可以用多聚甲醛保存。做DNA倍體的樣本:將樣本保存在70%的乙醇中,并適量加入血清,-70℃冰箱保存,可以幾個(gè)月內(nèi)檢測。
5 抗體染色的細(xì)胞不能立即檢測該如何處理?
如果實(shí)驗(yàn)對(duì)細(xì)胞活性要求比較高,如凋亡實(shí)驗(yàn),必須盡快檢測;
如果實(shí)驗(yàn)對(duì)細(xì)胞活性要求不高,可以使用含有4%多聚甲醛的PBS固定樣本30分鐘,固定后的細(xì)胞4℃過夜保存,次日檢測。
6 同型對(duì)照的作用是什么?
抗體有時(shí)會(huì)和非抗原結(jié)合,可能會(huì)因?yàn)榉翘禺惖牡鞍?蛋白相互作用結(jié)合細(xì)胞內(nèi)成分,因?yàn)槭杷饔媒Y(jié)合脂肪,也可能會(huì)結(jié)合一些細(xì)胞表面表達(dá)的抗體受體。比如,IgG亞型的抗體會(huì)結(jié)合細(xì)胞表面的Fc受體,如CD16、CD32和CD64。理想條件下,各種類型的非特異性結(jié)合都可以通過蛋白(BSA、牛奶或動(dòng)物血清)來阻斷。Fc受體的結(jié)合則可以通過與含免疫球蛋白的血清預(yù)孵育來阻斷。一個(gè)抗體非特異性相互作用和受體結(jié)合的情況,可以用無關(guān)抗原的相同亞型抗體來比照。
7什么時(shí)候需要使用同型對(duì)照?
做胞內(nèi)流式實(shí)驗(yàn):比如胞內(nèi)細(xì)胞因子、趨化因子和信號(hào)蛋白等。
表面標(biāo)志特異性不高或者不常見的: 一些特異性不高的抗體,如多抗,非特異性結(jié)合非常多,使用同型對(duì)照可排除假陽性; 因?yàn)椴皇煜げ怀R姌?biāo)志的表達(dá)情況,根據(jù)同型對(duì)照可以判斷陽性細(xì)胞的位置。對(duì)流式非常熟悉,且檢測的是CD3、CD4、CD19等表達(dá)強(qiáng)度非常高的標(biāo)志,可以不使用同型對(duì)照。
8怎樣選擇同型對(duì)照?
一般選擇與一抗的成分相同種屬來源、相同亞型和亞鏈、相同熒光標(biāo)記的抗體:
比如抗人的CD56 FITC標(biāo)記的抗體,亞型是Mouse IgG1,κ,那么它的同型對(duì)照應(yīng)該是FITC標(biāo)記的Mouse IgG1,κ。
如果是抗體的組合形式,純化的一抗+熒光標(biāo)記的二抗,那么應(yīng)該選擇一抗的同型對(duì)照:
比如CD86的純化抗體,亞型是Mouse IgG1,κ,二抗是PE標(biāo)記的抗小鼠IgG1,那么它的同型對(duì)照是純化的Mouse IgG1,κ。染色方式如下:樣本管,純化的CD86+PE標(biāo)記的抗Mouse IgG1(二抗)+樣本;同型對(duì)照管,純化的同型對(duì)照+PE標(biāo)記的抗Mouse IgG1(二抗)+樣本。如果沒有找到適合的同型對(duì)照,在保持來源相同、熒光標(biāo)記相同、免疫球蛋白類別相同條件下,優(yōu)先選擇的順序是亞鏈不同--亞型不同--相同類別,比如,某抗體的來源是Mouse IgG2а,κ。如果在同型對(duì)照表里找不到相同的同型對(duì)照,那么優(yōu)先選擇相同熒光標(biāo)記Mouse IgG2а為同型對(duì)照;如果也沒有找到Mouse IgG2а,那么優(yōu)先選擇相同熒光標(biāo)記的Mouse IgG2b作為同型對(duì)照;如果后還是沒有找到Mouse IgG2b,那么選擇相同熒光標(biāo)記的Mouse IgG2作為同型對(duì)照。
9為什么有時(shí)候同型對(duì)照的表達(dá)會(huì)比抗體的表達(dá)高?
首先需要檢查同型對(duì)照是否加錯(cuò)類型、劑量等。其次,因?yàn)橛行?biāo)志在流式細(xì)胞術(shù)的表面或者胞內(nèi)表達(dá)不高,而跟其類似的抗原非常多,那么加入同型對(duì)照時(shí),同型對(duì)照非特異性的結(jié)合會(huì)超過抗體的特異性,所以會(huì)造成這種現(xiàn)象。這個(gè)時(shí)候推薦使用其他陰性對(duì)照,如空白對(duì)照等。
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