細(xì)胞上清:需保證各組間培養(yǎng)細(xì)胞的數(shù)量基本一致,細(xì)胞生長狀態(tài)良好。建議采用6孔板培養(yǎng)細(xì)胞,并保證細(xì)胞數(shù)量達(dá)到106左右,即細(xì)胞密度達(dá)70%-80%左右,即可收集培養(yǎng)液,于2-8℃、1000×g離心20分鐘,除去雜質(zhì)及細(xì)胞碎片,取上清檢測。
細(xì)胞裂解液:貼壁細(xì)胞用冷的PBS輕輕清洗,1000×g離心5分鐘后收集細(xì)胞;懸浮細(xì)胞可直接離心收集。收集的細(xì)胞用冷的PBS洗滌3次。每106個(gè)細(xì)胞中加入150-200μL PBS重懸(推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑;若含量很低,可減少PBS的體積),并通過反復(fù)凍融或超聲,使細(xì)胞破碎。將提取液于2-8℃、1500×g離心10分鐘,取上清檢測。
反復(fù)凍融:-80℃放置1h/液氮放置0.5h,然后置于30℃水浴鍋中,輕微振蕩,使其迅速融化,此操作反復(fù)2-3次即可。
超聲方法:用超聲波發(fā)生器,以振幅14μm超聲處理30 s,在冰水浴條件下,破碎細(xì)胞;或者使用超聲波破碎儀,200 W,2 s/次,間隙3 s,總時(shí)間5 min。
樣本中建議提前加入蛋白酶抑制劑,常規(guī)推薦PMSF:工作濃度:17~174μg/mL(0.1~1mM)。
細(xì)胞培養(yǎng)過程中,有許多條件需要摸索,包括細(xì)胞類型、培養(yǎng)基組分、細(xì)胞數(shù)量、生產(chǎn)狀態(tài)、干預(yù)條件和物質(zhì)等。前期基礎(chǔ)打得牢固,對后續(xù)ELISA或其他種類實(shí)驗(yàn)的開展,及結(jié)果的分析,具有更多的參考意義。
上海晶抗生物工程有限公司
地址:上海市金山工業(yè)區(qū)亭衛(wèi)公路6558號9幢2441室
版權(quán)所有:上海晶抗生物工程有限公司 備案號:滬ICP備16026504號-5 總訪問量:531802 站點(diǎn)地圖 技術(shù)支持:智慧城市網(wǎng) 管理登陸